STERILISASI

                                    STERILISASI

1)PENANAMAN

Sterilisasi Eksplan
Dicuci potongan organ yang akan dijadikan eksplan dengan air bersih, dicuci 2-3 kali, lalu diletakkan di dalam cawan petri atau erlenmeyer.
Ditimbang zat kimia yang akan digunakan untuk sterilisasi dan dilarutkan dalam aquadest steril sesuai dengan persentase yang dikehendaki.
Dibersihkan kedua bahan tersebut kedalam LAF dengan alkohol 96%.
Dimasukkan potongan organ/eksplan yang akan disterilisasi kedalam larutan pensteril sampai waktu yang dikehendaki. Selama itu erlenmeyer digoyang atau dishaker agar semua organ dapat kontak langsung dengan pensteril.
Dicuci eksplan tersebut dengan aquadest steril 2-3 kali, kemudian dipotong kecil-kecil dengan ukuran 0,5-1 cm, eksplan selanjutnya sudah siap untuk ditanam

 Penanaman Eksplan
Diambil eksplan dengan menggunakan pinset dan diletakkan di dalam petridrish, eksplan dipotong-potong dengan scalpel.
Dimasukkan potongan eksplan ke dalam erlenmeyer atau botol berisi media, sehingga permukaan yang teririt dapat bersentuhan dengan media.
Ditutup erlenmeyer atau botol dan diinkubasikan pada ruang inkubator sesuai dengan suhu dan intensitas cahaya yang dikehendaki.

Kesimpulan

Ø  Teknik isolasi penting dilakukan agar sample yang didapat benar-       benar murni dan tidak tercampur oleh mikrobia lain.

Ø  Teknik isolasi dan penanaman mikroba dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu streak  dan spread

 Contoh

Sterilisasi Tanaman (Eksplan) Kultur jaringan

Sebelumnya eksplan kultur jaringan (kuljar) harus dicuci dulu dengan detergen dan dibuang bagian yang tidak perlu. Sterilisasi dilakukan dengan menggunakan lebih dari satu bahan seperti alcohol, bahan pemutih pakaian dan HgCl2. Lamanya proses sterilisasi dan konsentrasi bahan tergantung jenis dan bagian tanaman yang digunakan. Prinsip dasar sterilisasi eksplan adalah mensterilkan eksplan dari berbagai mikroorganisme, tetapi eksplannya tidak ikut mati. Setiap tanaman memerlukan perlakuan khusus sehingga sebelum mengulturkan tanaman baru perlu melakukan percobaan sterilisasi.

Untuk dapat melakukan percobaan sterilisasi kultur jaringan dengan baik, kita bisa membuat kisaran konsentrasi dan waktu yang diperlukan untuk sterilisasi dengan rentang yang cukup lebar. Jika dengan konsentrasi tertentu tidak terkontaminasi tetapi eksplannya mati, berarti konsentrasinya harus diturunkan. Begitu juga sebaliknya, jika masih banyak kontaminannya, konsentrasi bahan harus dinaikkan supaya tidak terkontaminasi lagi. Sama juga halnya dengan waktu yang diperlukan untuk sterilisasi. Jika masih banyak kontaminasi, berarti proses sterilisasi harus lebih lama. Jika kita telah berhasil mendapatkan satu kultur jaringan saja yang bebas kontaminan, maka kita dapat memperbanyaknya dalam jumlah banyak.

Untuk meningkatkan efisiensi pensterilisasian pada kultur jaringan dapat menggunakan Tween 20 dengan cara meneteskan 1-2 tetes ke dalam larutan sterilisasi. Tujuannya supaya tegangan permukaan bahan disinfektan menjadi lebih rendah sehingga bahan disinfektan dapat menyentuh lekukan-lekukan kecil atau rongga-rongga kecil seperti celah-celah di antara bulu-bulu halus yang ada di eksplan sehingga eksplan benar-benar steril.

Semua peralatan dan bahan yang dipakai untuk sterilisasi eksplan kultur jaringan seperti Bunsen, cawan petri, botol kultur yang berisi media, botol bahan disinfektan, botol alkohol 70%, dan alat-alat disiapkan di dalam laminar air flow atau enkas. Setelah semua siap, proses sterilisasi bisa dimulai.

Eksplan kultur jaringan dimasukkan ke dalam larutan disinfektan pertama dengan konsentrasi dan waktu tertentu sambil dikocok-kocok, lalu dibilas dan dimasukkan kedalam larutan disinfektan kedua dan seterusnya hingga semua larutan disinfektan selesai dilakukan. Terakhir, eksplan dibilas dengan air steril sebanyak 3 kali, tujuannya supaya tidak terdapat sisa-sisa bahan disinfektan yang menempel di eksplan.

Selain sterilisasi dengan kombinasi berbagi bahan disinfektan, bisa juga dilakukan sterilisasi bertingkat (konsentrasi bahan disinfektan semakin rendah) untuk suatu disinfektan yang dibarengi dengan pembukaan setiap daun muda sampai mata tunas telanjang. Untuk kultur anter, anter dapat dipotong dari bunga dan disterilisasi menggunakan klorox (pemutih pakaian) dan HgCl2 dan tidak memerlukan sterilisasi bertingkat. 

·         Pengawetan makanan bertujuan agar bakteri yan masuk ke dalam makanan tidak dapat tumbuh   Caranya antara lain:

2) PENGASAPAN

Cara pengasapan ialah menaruh makanan dalam sebuah wadah kotak yang kemudian diasapi dari bawah. Cara pengawetan makanan ini sebenarnya tidak bisa membuat makanan awet dalam jangka waktu lama karena cara ini masih dipadukan dengan teknik pengasinan dan pengeringan.

Proses pengasapan juga termasuk cara kimia sebab bahan-bahan kimia dalam asap dimasukkan ke dalam makanan yang diawetkan. Apabila jumlah pemakaiannya tepat, pengawetan dengan bahan-bahan kimia dalam makanan sangat praktis karena dapat menghambat berkembangbiaknya mikroorganisme seperti jamur atau kapang, bakteri, dan ragi.

Contoh

Daging Ayam Asap
Pengasapan daging ayam dikerjakan setelah curing (penggaraman). curing dilakukan dengan cara perendaman dalam larutan bumbu-bumbu yang terdiri atas garam (NaCl), gula merah dan NaNO2. Suhu untuk curing sebaiknya 4̊̊C atau lebih rendah. Setelah itu baru diasap dengan cara pengasapan dingin apabila suhu pengasapan rendah (30-40̊̊C) atau dengan cara pengasapan panas apabila suhu pengasapan lebih tinggi (70-90̊̊C)

3) PENGGARAMAN

 menghambat pertumbuhan mikroorganisme pembusuk makanan dengan menaruh dalam larutan garam dengan kadar yang cukup tinggi.  Garam merupakan zat yang bisa menghambat pertumbuhan mikroorganisme pembusuk.

contoh ikan asin dan telur asin.

 4)PENGGULAAN

Cara pengawetan makanan ini dengan memasukkan makanan ke dalam medium yang mengandung gula dengan kadar konsentrasi  sebesar 40% untuk menurunkan kadar mikroorganisme. Jika kadar konsentrasinya 70% maka dapat mencegah kerusakan makanan.

Tujuannya adalah selain memberi rasa manis juga mencegah pertumbuhan mikroorganisme.

Contoh makanan yang diawetkan dengan cara ini adalah susu, dodol,  agar-agar, jeli, dan manisan buah.

 5)PENGASAMAN

Dengan merendam dalam larutan asam.

Contoh : pikel ( acar buah & sayur )

 6)PENYARINGAN

 Cara Cara sterilisasi dengan filtrasi (filtration)
 Sterilisasi dengan Cara filtrasi mikroorganisme tetap hidup hanya dipisahkan dari material. Bahan filter/filtrasi adalah sejenis porselin yang berpori yang dibuat khusus dari masing-masing pabrik.
Beberapa jenis filter yang biasa digunakan adalah : Filter Berkefeld V., Filter Coarse N, M dan W, Filter Fine, Filter Chamberland, Filter Seitz, Filter Sintered glass. Cara filtrasi tersebut hanya dipakai untuk sterilisasi larutan gula, cairan lainnya seperti serum atau sterilisasi hasil produksi mikroorganisme seperti enzym dan exotoxin dan untuk memisahkan fitrable virus dan bakteria dan organisme lainnya.

Sterilisasi dengan cara ini dilakukan dengan mengalirkan cairan atau gas pada saringan berpori kecil sehingga dapat menahan mikroorganisme dengan ukuran tertentu.

 Kegunaan:

-          untuk sterilisasi media yang tidak tahan terhadap pemanasan, misalnya Urea Broth ataupun untuk sterilisasi vaksin, serum, enzim, vitamin.

-          Meminimalkan kuman udara masuk untuk ruangan kerja secara aseptis

Virus seperti mikroorganisme tanpa dinding sel (mikroplasma) umumnya tidak dapat ditahan oleh filter.  

 7)PENYINARAN

           Sterilisasi dengan Penyinaran (radiasi)

-                      Sterilisasi dengan cara ini diperlukan jika sterilisasi panas maupun dingin tidak dapat dilakukan. Beberapa macam radiasi mengakibatkan letal terhadap sel-sel jasad renik dan mikroorganisme lain. Jenis radiasi termasuk bagian dari spkterum elektromagnetik, misalnya : sinar ultraviolet, sinar gamma, sinar x dan juga sinar katoda elektro kecepatan tinggi. Sinar ultraviolet mempunyai panjang gelombang 15-390 nm. Lampu sinar ultraviolet dengan panjang gelombang 260 – 270 nm, dimana sinar dengan panjang gelombang sekitar 265 nm mempunyai daya bakterisid yang tinggi. Lampu ultraviolet digunakan untuk mensterilkan ruangan, misalnya di kamar bedah, ruang pengisian obat dalam ampul dan flakon di industri farmasi, juga bisa digunakan diperusahaan makanan untuk mencegah pencemaran permukaan.

Sinar x mempunyai daya penetrasi lebih besar dibanding dengan sinar ultraviolet. Sinar gamma mempunyai daya penetrasi lebih besar dibandingkan dengan sinar x dan digunakan untuk mensterilkan material yang tebal, misalnya bungkusan alat-alat kedokteran atau paket makanan. Sinar katoda biasa dipakai menghapus hama pada suhu kamar terhadap barang-barang yang telah dibungkus

- Dalam mikro biologi radiasi gelombang cahaya yang banyak digunakan adalah pancaran cahaya ultraviolet, gamma atau sinar X dan cahaya matahari. cahaya matahari banyak mengandung cahaya ultraviolet, sehingga secara langsung dapat dipakai untuk proses sterilisasi; hal tersebut telah lama diketahui orang. cahaya ultraviolet bisa diperoleh dengan menggunakan katoda panas (emisi termis) yaitu ke dalam tabung katoda bertekanan rendah diisi dengan uap air raksa; panjang gelombang yang dihasilkan dalam proses tersebut biasanya dalam orde 2.500 s/d 2.600 Angstrom. Lampu merkuri yang banyak terpasang di jalan-jalan sesungguhnya banyak mengandung cahaya ultraviolet. Namun cahaya ultraviolet yang dihasilkan itu banyak diserap oleh tabung gelas yang dilaluinya, sehingga dalam proses sterilisasi hendaknya memperhatikan dosis ultraviolet.

Cahaya ultraviolet yang diserap oleh sel organisme yang hidup, khususnya oleh nukleotida maka elektron-elektron dan molekul sel hidup akan mendapat tambahan energi. Tambahan energi tersebut kadang-kadang cukup kuat untuk mengganggu bahkan merusak ikatan intramolekuler, seperti ikatan atom hidrogen dalam DNA. Perubahan intramolekuler tersebut menyebabkan kematian pada sel-sel tersebut. Beberapa plasma sangat peka terhadap cahaya ultraviolet sehingga mudah menjadi rusak.

Cahaya gamma mempunyai tenaga yang lebih besar dan pada cahaya ultraviolet dan merupakan pancaran pengion. Interaksi antara cahaya gamaa dengan materi biologis sangat tinggi sehingga mampu memukul elektron pada kulit atom sehingga menghasilkan pasangan ion (pair production). Cairan sel baik intraselluler maupun ekstraselluler akan terionisasi sehingga menyebabkan kerusakan dan kematian pada mikro organisme tersebut.
Sterilisasi dengan penyinaran cahaya gamma berdaya tinggi dipergunakan untuk objek-objek yang tertutup plastik (stick untuk swab, jarum suntik). Untuk makanan maupun obat-obatan tidak boleh menggunakan cahaya gamma untuk sterilisasi oleh karena akan terjadi perubahan struktur kimia pada makanan maupun obat-obatan tersebut.

  8) PEMANASAN

1.   Dengan pemanasan kering

 Pemanasan kering  kurang efektif apabila temperatur kurang tinggi. Untuk mencapai efektivitas diperlukan pemanasan mencapai temperatur antara 160°C s/d 180°C. Pada temperatur tersebut akan menyebabkan kerusakan pada sel-sel hidup dan jaringan; hal tersebut disebabkan terjadinya auto oksidasi sehingga bakteri pathogen dapat terbakar. Pada sistem pemanasan kering terdapat udara; hal mana telah diketahui bahwa udara merupakan penghantar panas yang buruk sehingga sterilisasi melalui pemanasan kering memerlukan waktu cukup lama, rata-rata waktu yang diperlukan 45 menit. Pada temperatur 160°C memerlukan waktu 1 jam, sedangkan pada temperatur 180°C memerlukan waktu 30 menit. Pada Cara pemanasan kering tersebut secara rutin dipergunakan untuk mensterilisasikan peralatan-peralatan pipet, tabung reaksi, stick swab, jarum operasi, jarum suntik, syringe. Oleh karena temperatur tinggi sangat mempengaruhi ketajaman jarum atau gunting maka hindarilah tindakan sterilisasi dengan Cara panas kering terhadap jarum dan gunting .

Pembakaran   

Cara Cara sterilisasi dengan incineration (pembakaran langsung).
peralatan-peralatan platina, khrome yang akan disteril dapat dilakukan melalui pembakaran  secara langsung pada nyala lampu bunzen hingga mencapai inerah padam. Hanya saja dalam proses pembakaran langsung tersebut peralatan-peralatan tersebut lama kelamaan menjadi rusak.

Keuntungannya: mikroorganisme akan hancur semuanya.

Alat yang digunakan adalah lampu spiritus/bunsen. Pembakaran dapat dilakukan dengan cara :

-          Memijarkan

Pembakaran dengan cara ini hanya cocok untuk alat-alat logam (ose, pinset, dll), yang dibiarkan sampai memijar. Dengan cara ini seluruh mikroorganisme, termasuk spora, dapat dibasmi.

-    Menyalakan

Dapat diartikan suatu pelintasan alat gelas (ujung pinset, bibir tabung, mulut erlenmeyer, dll) melalui nyala api. Cara ini merupakan hal darurat dan tidak memberikan jaminan bahwa mikroorganisme yang melekat pada alat dengan pasti terbunuh.

 Cara mensterilkan ose :

Ose disterilkan dengan cara dibakar pada nyala api lampu spiritus atau lampu gas. Pada waktu memanaskan ose, dimulai dari pangkal kawat dan setelah terlihat merah berpijar secara pelan-pelan pemansan dilanjutkan ke ujung ose. Hal ini dimaksudkan untuk mencegah terloncatnya kuman akibat pemanasan langsung dan terlalu cepat pada mata ose. Nyala api pada sterilisator mempunyai perbedaan dalam derajat panas.

-          ABCD (diarsir) : merupakan ruang oksidasi

-          ABCD                 : merupakan ruang reduksi

-          AB                       : dasar api

-          a                          : ruang oksidasi atas

-          b                          : ruang oksidasi bawah

-          c                          : ruang reduksi atas

-          d                          : ruang reduksi bawah

-          e                          : bagian yang paling tidak panas

Tempat yang paling panas adalah ruang oksidasi bawah yang letaknya kira-kira sepertiga bawah dari tingginya nyala api. Yang perlu diperhatikan :

-          jangan memegang mata ose dengan tangan sebelum ose disterilkan

-          jangan meletakkan ose di atas meja, tetapi letakkan pada tempat yang disediakan setelah disterilkan.

Dengan udara panas (hot air oven)

Cara ini menggunakan udara yang dipanaskan dan kering, serta berlangsung dalam sterilisator udara panas (oven). Pemanasan dengan udara panas dugunakan untuk sterilisasi alat-alat laboratorium dari gelas misalnya : petri, tabung gelas, botol pipet dll, juga untuk bahan-bahan minyak dan powder misalnya talk. Bahan dari karet, kain, kapas dan kasa tidak dapat ditserilkan dengan cara ini.

Setelah dicuci alat-alat yang akan disterilkan dikeringkan dan dibungkus dengan kertas tahan panas, kemudian dimasukkan dalam oven dan dipanaskan pada temperatur antara 150 - 170ºC, selama kurang lebih 90 – 120 menit. Hal yang perlu diperhatikan adalah bahwa di antara bahan yang disterilisasi harus terdapat jarak yang cukup, untuk menjamin agar pergerakan udara tidak terhambat. 

Cara sterilisasi dengan pemanasan secara intermittent/terputus-putus
John Tyndall (1877) memperoleh dari hasil penelitiannya bahwa pada temperatur didih (100°C) selama 1 jam tidak dapat mematikan semua mikroorganisme tetapi apabila air dididihkan berulang-ulang sampai lima kali dan setiap air mendidih istirahat berlangsung 1 menit akan sangat berhasil untuk mematikan kuman. Hal tersebut dapat dimengerti oleh karena dengan pemanasan intermittent lingkaran hidup pembentukan spora dapat diputuskan.

2.    Dengan pemanasan basah

 Cara sterilisasi dengan pemanasan dengan uap air dan pengaruh tekanan (auto slave)
Benda yang akan disuci hamakan diletakkan di atas lempengan saringan dan tidak langsung mengenai air di bawahnya. Pemanasan dilakukan hingga air mendidih (diperkirakan pada suhu 100°C), pada tekanan 15 lb temperatur mencapai 121°C. Organisme yang tidak berspora dapat dimatikan dalam tempo 10 menit saja. Banyak jenis spora hanya dapat mati dengan pemanasan 100°C selama 30 menit tetapi ada beberapa jenis spora dapat bertahan pada temperatur tersebut selama beberapa jam. Spora-spora yang dapat bertahan selama 10 jam pada temperatur 100°C dapat dimatikan hanya dalam waktu 30 menit apabila air yang mendidih tersebut ditambah dengan natrium carbonat (Na2 CO3 ).  

Dengan merebus

Digunakan untuk mensterilkan alat-alat seperti gunting, pinset, skalpel, jarum, spuit injeksi dan sebagainya dengan cara direbus dalam suasana mendidih selama 30-60 menit.

Dengan uap air panas

Digunakan terutama untuk mensterilkan media-media yang akan mengalami kerusakan bila dikerjakan dengan sterilisasi uap air panas dengan tekanan (autoklav) ataupun untuk alat-alat tertentu. Cara ini dijalankan dengan pemanasan 100ºC selama 1 jam. Perlu diingat bahwa dengan cara ini spora belum dimatikan, dan ada beberapa media yang tidak tahan pada panas tersebut (misalnya media Loewenstein, Urea Broth). Media tersebut disterilkan dengan cara sterilisasi bertingkat ataupun filtrasi. Alat yang digunakan adalah sterilisator, autoklav, dimana tekanan dalam autoklav dijaga tetap 1 atmosfer (klep pengatur tekanan dalam keadaan terbuka).

Dengan uap air bertekanan (Autoklav)

Dengan cara pengatur tekanan dalam autoklav, maka dapat dicapai panas yang diinginkan. Cara ini dipakai untuk sterilisasi media yang tahan terhadap pemanasan tinggi. Sterilisasi biasanya dijalankan dengan menggunakan panas 120ºC selama 10 – 70 menit tergantung kebutuhan. Hal yang perlu diperhatikan bila mengerjakan sterilisasi dengan menggunakan autoklav :

-          harus ditunggu selama bekerja

-          hati-hati bila mengurangi tekanan dalam autoklav (perubahann temperatur dan tekanan secara mendadak dapat menyebabkan cairan yang disterilkan meletus dan gelas-gelas dapat pecah).

Pada sterilisasi dengan pemanasan kering, bakteri akan mengalami proses oksidasi putih telur, sedang dengan sterilisasi panas basah, akan mengakibatkan terjadinya koagulasi putih telur bakteri. Dalam keadaan lembab jauh lebih cepat menerima panas daripada keadaan kering sehingga sterilisasi basah lebih cepat dibanding oksidasi).

Pasteurisasi

Digunakan untuk mensterilkan susu dan minuman beralkohol. Panas yang digunakan 61,7ºC selama 30 menit.